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使用方法:
一、樣品RNA的制備
、用自選方法抽提病毒樣品RNA。注意：可以選用本公司生產(chǎn)的一管式病毒RNAout
2、或柱式病毒RNAout。
二：RT（逆轉(zhuǎn)錄）反應(yīng)合成cDNA
.按下表配制RT反應(yīng)體系（20μL體系）
2.70℃保溫5分鐘變性模板后立即冰浴。
3.嚴(yán)格按順序加入6μLRTBuffer（含dNTP）和2μLMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（含RI），
反應(yīng)終體積為20μL。
4.42℃保溫60分鐘。此步為RT反應(yīng)。
5.70℃保溫0分鐘以終止反應(yīng)，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作為PCR模板使用，丌需要純化。
反應(yīng)五要素：
參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2%2B
引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長(zhǎng)度：5-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至0kb的片段。
③引物堿基：G%2BC含量以40-60%為宜，G%2BC太少擴(kuò)增效果不佳，G%2BC過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3＇端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3＇端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.～umol或0～00pmol，以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
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